紫一葡萄籽 ￥148

葡萄籽中的提取物，很多具有活性。其中原花青素的比較好的。原花青素屬生物黃酮類,可從許多植物中提取得到,如海岸松、葡萄、銀杏、山楂、可可、蘋果等,具有顯著的抗突變、降血壓、抗菌、抗病毒、抗心血管損傷、抗癌等活性,有維生素P之稱。自發(fā)現(xiàn)原花青素以來,國外對其藥理活性進行了許多體內(nèi)、體外和離體細胞實驗研究,但國內(nèi)這方面的研究起步較晚,只有零星報道。本研究采用生物化學發(fā)光法和分光光度法,測定了葡萄籽原花青素提取物(grapeprocyanidinsextract,GPE)清除活性氧、活性氮、抗脂質(zhì)過氧化及對DNA氧化損傷的保護功效,為開發(fā)相關(guān)保健品和藥用品提供自由基生物學方面的新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑　黃嘌呤、鄰菲羅林、魯米諾系Sigma產(chǎn)品。迭氮鈉為國產(chǎn)化學純。DNA系上海牛奶公司綜合廠產(chǎn)品。酵母干粉、調(diào)理酵母多糖、黃嘌呤氧化酶系本實驗室自制。鄰苯三酚、過氧化氫、抗壞血酸、硫酸銅、硫酸亞鐵、三氯乙酸、硫代巴比妥酸等均系國產(chǎn)分析純。
1.1.2　儀器　SHG-1型生物化學發(fā)光測量儀(上海檢測技術(shù)研究所上立儀器廠產(chǎn)品)。751-GW型分光光度計(上海分析儀器廠產(chǎn)品)。寶生牌臭氧多功能消毒機(凱鑫輕工有限公司產(chǎn)品)。

1.2 GPE的提取

根據(jù)文獻報道方法進行。新鮮巨峰葡萄(產(chǎn)自上海嘉定區(qū)馬陸鄉(xiāng))籽洗凈,于烘箱內(nèi)40℃恒溫干燥。取純葡萄籽100g粉碎,用300ml50%丙酮浸泡24小時,離心取上清液,重復三次。合并上清液后抽濾,濾液用石油醚萃取,收集下層褐色液體,重復萃取三次。下層褐色液體于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),所得濃縮液再用乙酸乙脂與水的混合液(體積比為2∶3)進行新一輪萃取,重復萃取三次。收集水相物質(zhì)冷凍干燥得GPE粉末,高效液相層析檢測其原花青素成分含量達80%以上。

2.2 對•OH的清除作用

GPE能有效清除•OH,且量效關(guān)系顯著,IC50約為90μg/ml。

2 結(jié)　果

2.1 對O•2的清除作用

檢測O•2、•OH、H2O2和全血吞噬細胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的多種活性氧的化學發(fā)光按文獻進行。檢測ONOO-(過氧亞硝基陰離子)的化學發(fā)光按照文獻報道的方法進行。檢測Fe2+誘發(fā)脂蛋白多不飽和脂肪酸過氧化的比色法按文獻報道方法進行。檢測DNA損傷的化學發(fā)光按文獻進行。

2.3 對H2O2的清除作用

GPE能有效抑制H2O2-魯米諾-OH-體系的化學發(fā)光,劑量依賴效應(yīng)明顯,IC50約為0.5μg/ml。GPE能明顯抑制由黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的O•2所引起的化學發(fā)光,量效關(guān)系明顯。其半抑制濃度(IC50)約為0.2μg/ml。

2.4 對ONOO-的清除作用

2.5 抗脂質(zhì)過氧化作用

O3和NaN3反應(yīng)產(chǎn)生的ONOO-可氧化魯米諾并使之受激發(fā)光?？寡趸瘎┣宄齇NOO-即可抑制該體系發(fā)光。GPE能有效清除ONOO-,清除率隨濃度增大而增大,IC50約為130μg/ml。

2.6 對全血嗜中性白細胞吞噬發(fā)光的影響

全血嗜中性白細胞吞噬調(diào)理酵母多糖時,出現(xiàn)“呼吸爆發(fā)”,產(chǎn)生O•2、•OH、H2O2和1O2等活性氧,活性氧使魯米諾受激發(fā)光。清除活性氧即可降低該體系發(fā)光強度。GPE能顯著抑制全血嗜中性白細胞吞噬發(fā)光,量效關(guān)系顯著,IC50約為10μg/ml。

2.7 對•OH引起的DNA損傷的保護作用

3 討論

CuSO4-Phen-Vit.C-H2O2-DNA化學發(fā)光體系的發(fā)光曲線會出現(xiàn)前后兩個峰,前峰代表Phen本身氧化發(fā)光,后峰代表體系中產(chǎn)生的•OH攻擊DNA,形成DNA損傷產(chǎn)物而發(fā)光。加入保護劑可使后峰峰值下降,有些保護劑還可使后峰峰位隨濃度的增大而后移。GPE對•OH引起的DNA損傷保護作用。本實驗前峰不明顯,在對照組(0μg/ml)及低濃度(1025μg/ml)曲線上不能見到,只有當后峰(在對照組位于6s處)峰位后移以后,才在3s處顯現(xiàn);后峰則十分顯著,且其峰值隨藥物濃度的增大而迅速下降,峰位隨藥物濃度的增大而迅速后移,在25μg/ml時峰值即被抑制了約70%,峰位也已被后移至42s處(后移了約36s)。

細胞的正常代謝活動也會產(chǎn)生包括活性氮在內(nèi)的各種活性氧,但正常情況下機體各種抗氧化酶或抗氧化劑能維持活性氧代謝的平衡。一旦這種平衡打破,造成體內(nèi)活性氧積聚,即可引起機體病變。人類的多種疾病,括腫瘤、心腦血管病、糖尿病、老年癡呆癥等,以及衰老都與活性氧有關(guān)。本研究結(jié)果顯示GPE能顯著抑制全血嗜中性白細胞吞噬發(fā)光,表明GPE能有效清除多種活性氧,是一種有效的活性氧清除劑。值得提及的是O•2和•OH這兩種活性氧,前者是各種活性氧的源頭,后者是氧化活性最強的活性氧。本研究顯示GPE能有效清除這兩種活性氧,即既能堵住活性氧產(chǎn)生的源頭O•2,又能清除氧化作用最強的•OH,揭示了GPE的高效抗氧化機制。近年來的研究表明,活性氮如NO、ONOO-等對機體造成的損傷,主要是由ONOO-所引起,所以清除ONOO-對于保護機體免受氧化損傷十分重要。本實驗結(jié)果顯示GPE清除ONOO-的IC50為130μg/ml,是一種有效的ONOO-清除劑。我們的實驗還顯示GPE對H2O2的清除能力尤其卓越,IC50僅為0.5μg/ml。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物壽命較長,具疏水性,易于透過細胞膜系統(tǒng)結(jié)合于DNA,生成脂質(zhì)。

本研究揭示,GPE是一種良好的抗氧化劑及DNA保護劑,這為GPE藥用及保健品的研發(fā)提供了自由基生物學的理論依據(jù)。

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